Structural and functionnal studies of SpNox, a prokaryotic NADPH oxidase
Caractérisation structurale et fonctionnelle de SpNox, une NADPH oxydase bactérienne
Résumé
As specialized reactive oxygen species (ROS) producers, the involvement of the NADPH oxidase (NOX) enzymes extends to many crucial physiological processes. Thus, a NOX misregulation can lead to a wide range of severe pathologies including atherosclerosis, hypertension, diabetic nephropathy, lung fibrosis, cancer, or neurodegenerative diseases giving this membrane protein a strong therapeutic interest.Despite the recent success in finding prokaryotic NOX homologs enabling the production of such proteins in quantity compatible with mechanistic studies, thus furnishing good models for both functional and structural studies, all the attempts to obtain a NOX structure at high resolution always remained abortive.Thus, using an interdisciplinary approach, this project aims to overcome the challenges of this membrane protein crystallization therefore increasing diffraction of the Streptococcus pneumoniae NOX homolog (SpNox) crystals and allowing to solve the first structure of a full length NOX homolog at atomic level, hampered by the presence of large hydrophobic zones contacts related to the inherent function of transmembrane electron transfer performed by this protein family and that can prevent the formation of crystal.Using a systematic approach involving both a salt and pH screening by the NanoDSF technic, the optimal conditions for detergent and buffer composition in which the enzyme combines significant activity associated with high thermostability has been identified therefore enabling to preserve the integrity of the protein in order to promote the quality of the crystals obtained.
En tant qu’enzymes spécialisées dans la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), le rôle des NADPH oxydases (NOX) s’étend à de nombreux processus physiologiques majeurs, et la dérégulation de celles-ci peut conduire à une grande variété de pathologies sévères, telles que le diabète ou les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, constituant ainsi une cible primordiale pour le développement de solutions thérapeutiques spécifiquement adaptées. Malgré la découverte récente d’homologues procaryotes de NOX, facilitant la production de ces protéines en quantités compatibles pour les études mécanistiques, et constituant ainsi des modèles favorisant l’étude fonctionnelle et structurale de la famille des NADPH oxydases, la résolution d’une structure haute résolution sous forme entière est toujours demeurée sans solution.Ainsi, à travers l’utilisation d’une approche interdisciplinaire, ce projet a pour but de relever les enjeux majeurs associés à l’obtention de cristaux dont la qualité de diffraction permettrait la résolution de la première structure d’un homologue de NADPH oxydase sous forme entière issu de Streptococcus pneumoniae (SpNox), complexifiée par la présence de larges zones hydrophobes intrinsèques au rôle de transfert d’électrons à travers les membranes de ces protéines, et pouvant altérer la formation et l’intégrité des contacts cristallins.Des conditions optimales de détergents et de tampons au sein de laquelle l’enzyme combine une importante activité associée à une haute thermostabilité ont été identifiées par criblage systématique des conditions de sels et pH pour la purification de l’enzyme et ainsi optimiser la préservation de l’intégrité de la protéine afin de favoriser la qualité des cristaux obtenus. De plus, à travers l’implémentation d’étapes conjointes de criblages ainsi que d’affinements automatiques et manuels extensifs, un effort intense a ainsi été initié afin d’optimiser le processus de cristallogenèse et des avancées majeures ont pu être réalisées concernant la cristallisation de SpNox permettant d’améliorer la diffraction des cristaux initiaux de 11Å à 4.3Å.En parallèle, une caractérisation basse résolution, réalisée par diffusion des neutrons aux petits angles, a permis de déterminer une enveloppe globale de la protéine. Le volume de cette enveloppe, plus large que le modèle d’homologie de la protéine sous forme entière reconstituée par l’ancrage des deux domaines modélisés indépendamment, suggère l’existence d’une flexibilité importante de SpNox dans la région charnière entre les domaines TM et DH, fournissant ainsi des informations essentielles et apportant une explication aux difficultés rencontrées pour abaisser la limite de résolution des cristaux.Afin de s‘affranchir de la flexibilité liée à la présence de deux domaines structuralement indépendants au sein de la protéine, une stratégie complémentaire, impliquant la caractérisation structurale de chacun des domaines dissociés de SpNox a été initiée en caractérisant indépendamment avec succès les domaines transmembranaire (TM) et déshydrogénase (DH) de SpNox. Des développements considérables ont été réalisés grâce à l’obtention de cristaux du domaine déshydrogénase, dont la qualité a permis la collecte de données selon des limites de diffraction atteignant 1.8Å permettant ainsi d’accéder à des informations à une résolution atomique, autorisant la visualisation de détails structuraux au sein de ce domaine, qui, en association avec le modèle d’homologie du TM obtenu par une approche bioinformatique, peut servir à guider certaines études fonctionnelles.
Origine : Version validée par le jury (STAR)