The SUMOylation of the kinetochore and its effects on the chromosome segregation
La SUMOylation du kinétochore et ses effets sur la ségrégation chromosomique
Résumé
Some proteins of the kinetochore that is the proteineous interface between the microtubules and the centromeres have been identified as linked to SUMO, an ubiquitin-like protein. In human cells the removal of SENP6, which acts for disassembling of poly-SUMO chains, leads to the proteasomal degradation of CENP-I (CENtromere Protein-I) through SUMO-targeted ubiquitin ligases. The mechanisms underlying the SUMO modifications regulating the kinetochore structure and functions are mostly unknown. My thesis work is focused on the use of biochemical assays to identify the lysines involved in the SUMOylation of CENP-I, to reconstitute in vitro kinetochore and to perform SUMOylation assays on the whole kinetochore. The in vitro SUMOylated CENP-I were analyzed by mass spectrometry analysis. Thus, the aim of this project was to generate unSUMOylated CENP-I mutants and determine the effects of these mutants on kinetochore architecture. I reconstituted in vitro kinetochores according to a published protocol. However, these kinetochores-like structures are too instable for biochemical assays. To bypass these limitations, I adapted another approach to recreate in vitro kinetochores by fusing CENP-T to the LacI system. I succeeded in recruiting some kinetochore proteins, nevertheless I faced several issues with this system leading for the need of a further optimization.
Certaines protéines du kinétochore, l'interface protéique entre les microtubules et les centromères, ont été identifiées comme étant régulées par SUMO, une protéine de type ubiquitine. Dans des lignées cellulaires humaines, la déplétion de SENP6, une isopeptidase clivant les chaînes poly-SUMO, entraîne la dégradation protéasomale de CENP-I au moyen de ligases-ubiquitine dépendantes de SUMO. Cependant, les mécanismes liant la régulation du kinétochore et la SUMOylation restent largement méconnus. Mon travail doctoral est orienté vers l'utilisation d'essais biochimiques afin d'identifier les lysines impliquées dans la SUMOylation de CENP-I et de reconstituer des kinétochores in vitro et 3) d'étudier l'impact de la SUMOylation sur cette structure. Les produits de la SUMOylation in vitro de CENP-I ont été analysés par spectrométrie de masse afin d'identifier les lysines associées. J'ai aussi reconstitué des kinétochores in vitro en suivant un protocole publié. Cependant, ces kinétochores sont trop instables pour être utilisés dans des essais biochimiques. Pour pallier ces limitations, j'ai adapté une autre approche en fusionnant CENP-T au système LacI. Si ce système m'a permis de recruter certaines des protéines du kinétochore, il génère des contraintes nécessitant de plus amples optimisations pour être utilisé lors d'études biochimiques.
Domaines
Biochimie [q-bio.BM]
Origine : Version validée par le jury (STAR)